HL-60细胞内一种新的全反式维甲酸应答基因的克隆①
作者：王吉伟 王顺伟 田菁燕 陈汉春 罗志勇 曾海涛
单位：王吉伟 王顺伟 田菁燕 陈汉春 罗志勇 曾海涛(分子生物学研究中心 长沙 410078)
关键词：髓系白血病细胞；克隆；分子；维甲酸；多聚酶链反应；顺序分析；脱氧核糖核酸；细胞分化；印迹法；Northern
湖南医科大学学报990602
提要 利用差示PCR技术从HL-60细胞内克隆出一个新的、差异表达的cDNA片段，并将其命名为W-1基因。Northern印迹杂交证实，用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化时，W-1基因的转录水平在诱导早期增加而在诱导24h后关闭。推测W-1基因可能在HL-60细胞早期分化中有一定作用。
中国图书分类号 Q75
, 百拇医药
Cloning of a new cDNA: Responded to all-trans
retinoic acid in HL-60 cell differentiation
Wang Jiwei Wang Sunwei Tian Qingyan Chen Hanchun Luo Zhiyong Zeng Haitao
(Research Center of Molecular Biology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In this paper a new type of cDNA fragment named as W-1 gene was first cloned and seq uenced from ATRA induced HL-60 cells by using differential display PCR (DD-PCR ) and DNA sequencing techniques. These differentially expressing products of the gene responding to ATRA were further confirmed by Northern blotting analysis. T he results showed that the expressing level of this gene induced by ATRA (10 -6mol.L-1) for 16hrs was much higher than that in the control HL-6 0 cells, but its expression in HL-60 was reduced to an unestimable level after induction of ATRA (10-6mol.L-1) for 24hrs. It suggests that AT RA may increase the expression of W-1 gene during the early stage of HL-60 cel l differentiation. The exact mechanism of action is being studied further.
, 百拇医药
Key words myeloid leukemic cell; retinoic acid; polymerase c hain reaction; cell differentiation; sequence analysis,DNA; W-1 gene*; bl otting,Northern
造血细胞的分化受一组特定基因的适时“开、关”所决定与调控；这些分化相关基因的异常表达与白血病的发生、发展密切相关。目前已知，全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)能通过纠正此类基因的异常表达，诱导某些白血病细胞的分化。因而筛选受ATRA调控的基因便成为一个重要课题。作者用差示多聚酶链反应(差示PCR：differential display PCR, DD-PCR)技术比较了白血病衍生株HL-60细胞在ATRA作用前、后的基因表达指纹，克隆出一条长度约为800bp的表达差异的cDNA片段，为进一步阐明ATRA诱导癌细胞分化的机制提供新的研究对象。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 HL-60细胞由我校中心实验室提供：RPMI-1640培养基和小牛血清分别购自美国GIBCO公司和上海华美生物工程公司；全反式维甲酸系美国Sigma公司产品；所有引物均在加拿大Sangon公司合成；32P标记的dATP,dCTP及ATP由北京亚辉生物工程公司提供；聚丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、5-溴--氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、各种工具酶及试剂盒等分别购自美国Promega公司及德国宝灵曼公司；其它常规消耗品由长沙市兴海化玻公司等我国厂家提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及药物作用条件 按常规方法培养HL-60细胞，对数生长期收集细胞并调节细胞数至1×105.ml-1。实验组加入新配制的ATRA(1000×母液，无水乙醇配制)至终浓度为10-6mol.L-1；对照组加入等量无水乙醇。两组于不同培养时段回收细胞。
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1.2.2 逆转录反应 用Promega公司的总RNA提取试剂盒提取HL-60细胞的总RNA。用DNA酶去除污染的DNA后，按分子克隆常规方法合成cDNA第一链[1]。所用引物为T12VG(V=A,G或C)。
1.2.3 差异区带的显示及二次PCR扩增[2] 所用5′随机引物为AP1(5′-TTCGATTGCC-3′)，AP2(5′-TTCCATTGCG-3′)。以32PdATP代替35SdATP掺入反应产物。每个PCR反应管加1μCi32PdATP。
1.2.4 差异区带的克隆及验证 按试剂盒说明将二次PCR产物连接于pGEM-T质粒载体，转化到大肠杆菌DH5a细胞内，插入片段用BstZ1酶切回收后用作Northern印迹杂交的探针。通过OD260光密度值及18s和28sRNA区带的相对荧光强度确定RNA的上样量。
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1.2.5 差异区带的测序 根据Sanger双脱氧链终止法 ，参照Promega公司的T7测序试剂盒操作说明书进行。
2 结 果
2.1 mRNA差异显示 用6%聚丙烯酰胺测序胶分离差示PCR反应产物，回收其中一条差异区带(图1箭头所示)用于二次PCR扩增。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，二次PCR产物除了一条主要的大片段外，还存在多条含量较少的小片段(图2)。
图1 HL-60细胞内的差异表达(6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析) 1.对照组 2.ATRA诱导24h 箭头处为差异表达区带 图2 差异区带二次PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 图3 差异cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱 M1.ΦX174DNA/HaeⅢ标志物 1.pGEM-T载体DNA 2.重组质粒DNA 3.经BstZI消化的重组质粒DNA 4.经低熔点胶回收的差异DNA片段 M2.λDNA/HindⅢ标志物图4 重组质粒DNA经AluⅠ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱 ΦX174DNA/HaeⅢ标志物 1～5.五个单独菌落提取的质粒DNA 图5 差异基因片段的Northern杂交结果 1.对照组 2.ATRA作用16h 3.ATRA作用24h
, 百拇医药
Fig. 1 Differentially expressed genes in HL-60 cells by DD-PCR(6% PAGE analysis) 1. control 2. ATRA induction for 24h An arrow indicates the differential expressed band Fig. 2 PAGE pattern of differentially expressed gene bands from the amplified products of second PCR Fig. 3 Agarose gel electropharetic profile of the differentially expressed cDNA fragments
M1. λDNA/HindⅢ size markers(in bp) 1.pGEM-T vector DNA 2. recombinant plasmid DNA 3. digests of the recombinan t plasmid DNA with BstZ1 4.fragment of the differentially expressed cDNA recove red M2. ΦX174DNA/Hae Ⅲ size markers(in bp) Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of recombina nt plasmid DNA after Alu Ⅰ digestion M.ΦX174DNA/Hae Ⅲ markers(in bp) 1～5.A lu Ⅰ digests of plasmid DNA extracted from five single colonies Fig. 5 Northern hybridization of the differenti ally expressed genes 1.control 2.ATRA induction for 16h 3.ATRA induction for 24h
, 百拇医药
2.2 差异片段的克隆及验证 鉴于二次PCR产物含有长度不同的DNA片段，笔者直接从凝胶上将含有大片段DNA的胶块剥离，回收、纯化后与pGEM-T载体连接并转化至DH5α菌内。酶切结果证实插入片段来自长度约800bp的主要区带(图3)。曾有报道，位于同一区带的DNA可能包含其它不具有差异表达的DNA污染[3]。为此进一步检测了多个阳性克隆的AluⅠ酶切图谱，结果表明各阳性克隆的限制性图谱一致(图4)。证实所得克隆产物并无其它DNA污染。由于测序胶上的差异带并不一定是真正的表达差异带，故尚须用Northern印迹杂交进一步验证。如图5所示，此基因的mRNA含量在ATRA作用24h后骤减至不可测水平，证实为一个特异的差异表达基因。
2.3 差异DNA的序列测定 读得的部分核苷酸序列如下：ACTGTGATGTCAATATCACATGT-
TTGTTATTAAATTCTCAATTTAAATTAAAAAGG-TAGACAACTATA
, 百拇医药
将获得的cDNA序列输入GenBank数据库检索。未见其它已知序列与其有较高的同源，故可判断此片段来自一个新的cDNA基因。笔者将此cDNA基因命名为W-1基因。
3 讨 论
ATRA作为一种典型的分化诱导剂，能诱导HL-60细胞向成熟粒系分化。筛选各种受ATRA调控的基因并对其机能加以研究，有助于理解造血分化机制进而指导对白血病的分化治疗。目前，已有许多受ATRA调控的基因被发现。例如，Linda等[4]曾报道，在维甲酸作用小鼠早幼粒细胞株MPRO细胞15min后，E3基因的转录水平即开始增加，4h后回落至稳定水平。将维甲酸受体α(RARα)基因导入缺乏RARα的HL-60抗性细胞后，可诱导E3对ATRA的应答明显增加，故认为E3是RARα的靶基因。此外，陈竺研究小组也筛选出两个维甲酸诱导基因E和G[5，6]。通过对其序列同源性的比较提出，维甲酸与干扰素可协同诱导细胞分化。谭孟群等[7]报道，在轻度热处理下，维甲酸还能促进HL-60细胞凋亡。鉴于本研究所克隆的W-1cDNA基因的mRNA水平在ATRA作用早期便升高，推测它是一个受ATRA调控的靶基因。W-1基因的表达在24h后关闭，提示其作用主要发生于HL-60细胞分化的早期，并在随后的分化过程中有某种沉默机制抑制了它的转录。GenBank数据库上没有已知序列与W-1基因同源，认为W-1基因是一个新的cDNA序列。由于本文筛选到的差异表达cDNA片段长度高达800bp，而通常的cDNA的基因的3′非编码区序列的长度大多仅300～400bp，预期此片段的5′端已处于W-1基因的编码区，从而方便了今后对此基因全长cDNA的克隆。目前，本研究小组正在进行此项工作。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:345～368
2 Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992,257:967～971
3 Callard D, Lescure B, Mazzolini B.A method for the elimination of false po sitives generated by the mRNA differential display-technique. Bio Techniques,1 994,16(6):1096～1103
, http://www.100md.com
4 Scott LM, Mueller L, Collins SJ, et al. E3, a hematopoietic-specific transcript directly regulated by the retinoic acid receptor α. Blood, 1996,88:2517～2530
5 Mao M, Yu M. Tong JH, et al. RIG-E, a human homolog of the urine LY-6 family, is induced by retinoic acid during the differentiation of acute promyeloc ytic leukemia cell. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:5910～5914
6 Yu M, Tong JH, Mao M, et al. Cloning of a gene (RIG-G) associated with r etinoic acid- induced differentiation of acute promyelocytic leukemia cells and representing a new member of a family of interferon stimulated genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94:7406～7410
7 谭孟群，卿科云，蒋德昭，等.维甲酸与粒-巨噬系集落刺激因子对温热诱导HL-60细胞凋亡的影响.湖南医科大学学报，1998，23(6)：524～526, 百拇医药
单位：王吉伟 王顺伟 田菁燕 陈汉春 罗志勇 曾海涛(分子生物学研究中心 长沙 410078)
关键词：髓系白血病细胞；克隆；分子；维甲酸；多聚酶链反应；顺序分析；脱氧核糖核酸；细胞分化；印迹法；Northern
湖南医科大学学报990602
提要 利用差示PCR技术从HL-60细胞内克隆出一个新的、差异表达的cDNA片段，并将其命名为W-1基因。Northern印迹杂交证实，用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化时，W-1基因的转录水平在诱导早期增加而在诱导24h后关闭。推测W-1基因可能在HL-60细胞早期分化中有一定作用。
中国图书分类号 Q75
, 百拇医药
Cloning of a new cDNA: Responded to all-trans
retinoic acid in HL-60 cell differentiation
Wang Jiwei Wang Sunwei Tian Qingyan Chen Hanchun Luo Zhiyong Zeng Haitao
(Research Center of Molecular Biology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In this paper a new type of cDNA fragment named as W-1 gene was first cloned and seq uenced from ATRA induced HL-60 cells by using differential display PCR (DD-PCR ) and DNA sequencing techniques. These differentially expressing products of the gene responding to ATRA were further confirmed by Northern blotting analysis. T he results showed that the expressing level of this gene induced by ATRA (10 -6mol.L-1) for 16hrs was much higher than that in the control HL-6 0 cells, but its expression in HL-60 was reduced to an unestimable level after induction of ATRA (10-6mol.L-1) for 24hrs. It suggests that AT RA may increase the expression of W-1 gene during the early stage of HL-60 cel l differentiation. The exact mechanism of action is being studied further.
, 百拇医药
Key words myeloid leukemic cell; retinoic acid; polymerase c hain reaction; cell differentiation; sequence analysis,DNA; W-1 gene*; bl otting,Northern
造血细胞的分化受一组特定基因的适时“开、关”所决定与调控；这些分化相关基因的异常表达与白血病的发生、发展密切相关。目前已知，全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)能通过纠正此类基因的异常表达，诱导某些白血病细胞的分化。因而筛选受ATRA调控的基因便成为一个重要课题。作者用差示多聚酶链反应(差示PCR：differential display PCR, DD-PCR)技术比较了白血病衍生株HL-60细胞在ATRA作用前、后的基因表达指纹，克隆出一条长度约为800bp的表达差异的cDNA片段，为进一步阐明ATRA诱导癌细胞分化的机制提供新的研究对象。
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1 材料与方法
1.1 材料 HL-60细胞由我校中心实验室提供：RPMI-1640培养基和小牛血清分别购自美国GIBCO公司和上海华美生物工程公司；全反式维甲酸系美国Sigma公司产品；所有引物均在加拿大Sangon公司合成；32P标记的dATP,dCTP及ATP由北京亚辉生物工程公司提供；聚丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、5-溴--氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、各种工具酶及试剂盒等分别购自美国Promega公司及德国宝灵曼公司；其它常规消耗品由长沙市兴海化玻公司等我国厂家提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及药物作用条件 按常规方法培养HL-60细胞，对数生长期收集细胞并调节细胞数至1×105.ml-1。实验组加入新配制的ATRA(1000×母液，无水乙醇配制)至终浓度为10-6mol.L-1；对照组加入等量无水乙醇。两组于不同培养时段回收细胞。
, 百拇医药
1.2.2 逆转录反应 用Promega公司的总RNA提取试剂盒提取HL-60细胞的总RNA。用DNA酶去除污染的DNA后，按分子克隆常规方法合成cDNA第一链[1]。所用引物为T12VG(V=A,G或C)。
1.2.3 差异区带的显示及二次PCR扩增[2] 所用5′随机引物为AP1(5′-TTCGATTGCC-3′)，AP2(5′-TTCCATTGCG-3′)。以32PdATP代替35SdATP掺入反应产物。每个PCR反应管加1μCi32PdATP。
1.2.4 差异区带的克隆及验证 按试剂盒说明将二次PCR产物连接于pGEM-T质粒载体，转化到大肠杆菌DH5a细胞内，插入片段用BstZ1酶切回收后用作Northern印迹杂交的探针。通过OD260光密度值及18s和28sRNA区带的相对荧光强度确定RNA的上样量。
, 百拇医药
1.2.5 差异区带的测序 根据Sanger双脱氧链终止法 ，参照Promega公司的T7测序试剂盒操作说明书进行。
2 结 果
2.1 mRNA差异显示 用6%聚丙烯酰胺测序胶分离差示PCR反应产物，回收其中一条差异区带(图1箭头所示)用于二次PCR扩增。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，二次PCR产物除了一条主要的大片段外，还存在多条含量较少的小片段(图2)。
图1 HL-60细胞内的差异表达(6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析) 1.对照组 2.ATRA诱导24h 箭头处为差异表达区带 图2 差异区带二次PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 图3 差异cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱 M1.ΦX174DNA/HaeⅢ标志物 1.pGEM-T载体DNA 2.重组质粒DNA 3.经BstZI消化的重组质粒DNA 4.经低熔点胶回收的差异DNA片段 M2.λDNA/HindⅢ标志物图4 重组质粒DNA经AluⅠ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱 ΦX174DNA/HaeⅢ标志物 1～5.五个单独菌落提取的质粒DNA 图5 差异基因片段的Northern杂交结果 1.对照组 2.ATRA作用16h 3.ATRA作用24h
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Fig. 1 Differentially expressed genes in HL-60 cells by DD-PCR(6% PAGE analysis) 1. control 2. ATRA induction for 24h An arrow indicates the differential expressed band Fig. 2 PAGE pattern of differentially expressed gene bands from the amplified products of second PCR Fig. 3 Agarose gel electropharetic profile of the differentially expressed cDNA fragments
M1. λDNA/HindⅢ size markers(in bp) 1.pGEM-T vector DNA 2. recombinant plasmid DNA 3. digests of the recombinan t plasmid DNA with BstZ1 4.fragment of the differentially expressed cDNA recove red M2. ΦX174DNA/Hae Ⅲ size markers(in bp) Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of recombina nt plasmid DNA after Alu Ⅰ digestion M.ΦX174DNA/Hae Ⅲ markers(in bp) 1～5.A lu Ⅰ digests of plasmid DNA extracted from five single colonies Fig. 5 Northern hybridization of the differenti ally expressed genes 1.control 2.ATRA induction for 16h 3.ATRA induction for 24h
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2.2 差异片段的克隆及验证 鉴于二次PCR产物含有长度不同的DNA片段，笔者直接从凝胶上将含有大片段DNA的胶块剥离，回收、纯化后与pGEM-T载体连接并转化至DH5α菌内。酶切结果证实插入片段来自长度约800bp的主要区带(图3)。曾有报道，位于同一区带的DNA可能包含其它不具有差异表达的DNA污染[3]。为此进一步检测了多个阳性克隆的AluⅠ酶切图谱，结果表明各阳性克隆的限制性图谱一致(图4)。证实所得克隆产物并无其它DNA污染。由于测序胶上的差异带并不一定是真正的表达差异带，故尚须用Northern印迹杂交进一步验证。如图5所示，此基因的mRNA含量在ATRA作用24h后骤减至不可测水平，证实为一个特异的差异表达基因。
2.3 差异DNA的序列测定 读得的部分核苷酸序列如下：ACTGTGATGTCAATATCACATGT-
TTGTTATTAAATTCTCAATTTAAATTAAAAAGG-TAGACAACTATA
, 百拇医药
将获得的cDNA序列输入GenBank数据库检索。未见其它已知序列与其有较高的同源，故可判断此片段来自一个新的cDNA基因。笔者将此cDNA基因命名为W-1基因。
3 讨 论
ATRA作为一种典型的分化诱导剂，能诱导HL-60细胞向成熟粒系分化。筛选各种受ATRA调控的基因并对其机能加以研究，有助于理解造血分化机制进而指导对白血病的分化治疗。目前，已有许多受ATRA调控的基因被发现。例如，Linda等[4]曾报道，在维甲酸作用小鼠早幼粒细胞株MPRO细胞15min后，E3基因的转录水平即开始增加，4h后回落至稳定水平。将维甲酸受体α(RARα)基因导入缺乏RARα的HL-60抗性细胞后，可诱导E3对ATRA的应答明显增加，故认为E3是RARα的靶基因。此外，陈竺研究小组也筛选出两个维甲酸诱导基因E和G[5，6]。通过对其序列同源性的比较提出，维甲酸与干扰素可协同诱导细胞分化。谭孟群等[7]报道，在轻度热处理下，维甲酸还能促进HL-60细胞凋亡。鉴于本研究所克隆的W-1cDNA基因的mRNA水平在ATRA作用早期便升高，推测它是一个受ATRA调控的靶基因。W-1基因的表达在24h后关闭，提示其作用主要发生于HL-60细胞分化的早期，并在随后的分化过程中有某种沉默机制抑制了它的转录。GenBank数据库上没有已知序列与W-1基因同源，认为W-1基因是一个新的cDNA序列。由于本文筛选到的差异表达cDNA片段长度高达800bp，而通常的cDNA的基因的3′非编码区序列的长度大多仅300～400bp，预期此片段的5′端已处于W-1基因的编码区，从而方便了今后对此基因全长cDNA的克隆。目前，本研究小组正在进行此项工作。
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参 考 文 献
1 Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:345～368
2 Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992,257:967～971
3 Callard D, Lescure B, Mazzolini B.A method for the elimination of false po sitives generated by the mRNA differential display-technique. Bio Techniques,1 994,16(6):1096～1103
, http://www.100md.com
4 Scott LM, Mueller L, Collins SJ, et al. E3, a hematopoietic-specific transcript directly regulated by the retinoic acid receptor α. Blood, 1996,88:2517～2530
5 Mao M, Yu M. Tong JH, et al. RIG-E, a human homolog of the urine LY-6 family, is induced by retinoic acid during the differentiation of acute promyeloc ytic leukemia cell. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:5910～5914
6 Yu M, Tong JH, Mao M, et al. Cloning of a gene (RIG-G) associated with r etinoic acid- induced differentiation of acute promyelocytic leukemia cells and representing a new member of a family of interferon stimulated genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94:7406～7410
7 谭孟群，卿科云，蒋德昭，等.维甲酸与粒-巨噬系集落刺激因子对温热诱导HL-60细胞凋亡的影响.湖南医科大学学报，1998，23(6)：524～526, 百拇医药